Os primeiros cirurgiões do genoma

Os cientistas construíram ferramentas que podem editar o DNA de forma barata e fácil. Agora eles estão se preparando para trazê-los para a clínica para curar doenças.

UC San Francisco (UCSF) Blocked Desbloquear Seguir Seguindo 23 de outubro de 2018

De Ariel Bleicher

Bruce Conklin, MD (foto, à direita) está testando cirurgias baseadas em CRISPR em células doadas por Delaney Van Riper (foto, à esquerda). Essas cirurgias visam curar pacientes como ela que têm distúrbios genéticos raros. (Crédito da foto: Steve Babuljak)

Uma tarde de julho, nas profundezas dos corredores labirínticos do prédio de ciências médicas do campus da UCSF, na avenida Parnassus, o laboratório de Alex Marson, MD, PhD, está agitado. Portas aplaudem. Luvas se encaixam. Teclados clack. As células incubam em banhos de nutrientes da cor do Kool-Aid, enquanto as máquinas que se assemelham a panelas de arroz giram misturas de moléculas, separando grandes de pequenas. De vez em quando, uma impressora começa a fazer anotações para um novo experimento, como um pedido de almoço que chega à cozinha de um restaurante.

Theo Roth, um estudante de MD-PhD, abre um freezer profundo, liberando uma nuvem gelada. Aqui, em meio a caixas congeladas empilhadas em prateleiras geadas, está o ímpeto de toda essa atividade – a razão pela qual Roth e Marson e seus colegas da UCSF e de outros lugares começaram a suspeitar, sem muita empolgação, de que estão na vanguarda de uma nova era na medicina.

Roth pega uma caixa e tira um frasco de plástico transparente, não mais alto que uma tampa de pasta de dente. No interior, ele explica, há bilhões de moléculas intricadamente dobradas, semelhantes a fitas: proteínas conhecidas como Cas9. Quando ligadas a outras moléculas chamadas RNAs guia, as proteínas Cas9 se transformam em…

"… o sistema CRISPR mágico", diz Roth, segurando o frasco até a luz.
Seu conteúdo parece … bem, nada. "Apenas outro líquido claro", diz Roth – porque, como ele bem sabe, a humilde aparência dessas moléculas desmente um poder singular e extraordinário.

As próximas curas CRISPR

Se você já ouviu falar de CRISPR (pronuncia-se "crisper"), um tema quente nos círculos da ciência hoje em dia, você provavelmente encontrou uma série estonteante de definições e adivinhações. O CRISPR é uma terapia? Uma revolução? Um par de tesouras genéticas? Um editor de texto? Um motor de gênese? Um portal para bebês projetados? E o que esse acrônimo atraente – que significa “repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente e inter espaçadas” – significa mesmo?

“A cirurgia do genoma não é mais ficção científica. Está realmente descendo o pique. ”- Jennifer Doudna, PhD

Simplificando, CRISPR é uma ferramenta. Na verdade, são muitas as ferramentas – mais precisamente descritas como sistemas CRISPR – projetadas com precisão para operar na menor anatomia da vida: o DNA, a substância dos genes. Essas ferramentas não são as primeiras do tipo, mas são de longe as mais exigentes, as mais baratas e as mais fáceis de usar. Despachados em células vivas, eles podem manipular qualquer gene em qualquer tecido de qualquer organismo, seja micróbio, rato ou macaco.

Ou humano. Apenas seis anos após a descoberta da tecnologia CRISPR, centenas de laboratórios de pesquisa em todo o mundo a estão usando para estudar células de pacientes e criar modelos animais de doenças humanas – de doenças comuns a doenças hereditárias tão raras que podem afetar apenas alguns poucos. famílias. Esse corpo de pesquisa em rápido crescimento provou ser um benefício para a ciência médica, mostrando como o DNA – uma cadeia espiralada de bases químicas unidas como degraus em uma escada – nos mantém vivos e saudáveis, e até mesmo mudanças sutis neste código podem nos tornar doente.

Mas para médicos cientistas como Marson e jovens estagiários como Roth, a ascendência dos sistemas CRISPR gera uma esperança ainda maior: se essas ferramentas podem iluminar as causas da doença no laboratório, por que não trazê-las para a clínica para tratar pacientes?

Jennifer Doudna, PhD, foi pioneira nas primeiras aplicações CRISPR em 2012. (Crédito da foto: Steve Babuljak)

O que os cientistas da CRISPR imaginam – o futuro para o qual estão agora se preparando – é um novo campo da medicina. Eles até têm um nome para essa especialidade nascente: a cirurgia do genoma. Assim como os cirurgiões de hoje usam instrumentos de aço para extirpar tumores, reparar vasos sangüíneos ou transplantar rins, os cirurgiões do genoma de amanhã poderiam usar sistemas CRISPR para remover um gene defeituoso, corrigir outro ou substituir um terço – curando doenças genéticas na sua origem.

“Imagine um mundo onde as pessoas vão ao médico e sequenciam seu genoma e aprendem que têm um distúrbio genético”, diz Jennifer Doudna, PhD, que foi pioneira nas primeiras aplicações de CRISPR em 2012. “E em vez de dizer que precisam Para viver com esse transtorno, temos a tecnologia que pode realmente tratá-los – potencialmente até mesmo curá-los ”.

É uma visão grandiosa, mas que pode estar ao alcance. Em 2014, Doudna – que é professor de química e de biologia molecular e celular na UC Berkeley e pesquisador sênior do Gladstone Institutes, um instituto de pesquisa independente afiliado à UCSF – ajudou a fundar o Instituto Inovador de Genômica (IGI) , uma parceria entre UCSF e UC Berkeley para aplicar sistemas CRISPR para melhorar a saúde humana. (Sua missão mais tarde se expandiu para abranger a segurança alimentar e a sustentabilidade ambiental.) Desde então, equipes de pesquisadores e médicos na área da baía – muitos deles financiados pelo IGI – começaram a trabalhar em direção a novas cirurgias CRISPR que poderiam tratar uma matriz. de doenças, incluindo doenças genéticas do olho, nervos, rins, sangue e sistema imunológico.

"As possibilidades são incompreensíveis", diz Marson, professor associado de microbiologia e imunologia e diretor científico de biomedicina do IGI. Ele, juntamente com Roth e outros, está desenvolvendo técnicas baseadas em CRISPR destinadas a reprogramar as próprias células imunológicas dos pacientes para matar o câncer e afastar o HIV. O dia em que tratamentos como esses entram na clínica podem não estar tão distantes.

“A cirurgia de genoma não é mais ficção científica”, diz Doudna. "Está realmente descendo o pique."

Nova esperança para distúrbios raros

Enquanto a equipe de Marson se empenha em remodelar as células do sistema imunológico, a alguns quilômetros de distância, nos Institutos Gladstone, no campus Mission Bay da UCSF, um tipo diferente de cirurgia de genoma está em andamento. Lá, no laboratório do investigador sênior Bruce Conklin, MD – professor de medicina da UCSF e vice-diretor do IGI – as células de 19 anos de idade Delaney Van Riper estão passando por procedimentos experimentais que poderiam um dia curá-la de uma deficiência crescente.

"Quase universalmente, os primeiros alvos da cirurgia do genoma serão as doenças incuráveis, onde não há realmente outra opção." – Bruce Conklin, MD

Van Riper nasceu com uma doença rara chamada Charcot-Marie-Tooth (CMT), um dos mais de 6.000 distúrbios genéticos conhecidos, que surgem de variações específicas no DNA. Essas variações – chamadas de mutações – atiram uma chave na linha de produção de proteínas da célula, criando assim moléculas desviantes ou defunto, como móveis da Ikea montados a partir de instruções distorcidas. Em alguns casos, uma mutação em apenas uma base de DNA – de um total de 3 bilhões de pares de bases no genoma humano – pode causar estragos severos.

A mutação de Van Riper produz uma proteína errônea que degrada a capacidade de suas células nervosas de transmitir mensagens entre seu cérebro e seus músculos, fazendo com que ela lentamente perca o controle de seus membros. Ela foi diagnosticada aos 7 anos, depois que seu pai, um conselheiro genético, percebeu que ela não estava andando normalmente. Aos oito anos de idade, ela usava aparelho nas pernas, rindo junto com as crianças que a chamavam de Forrest Gump, “para que eles não me vissem como um aleijado”. Aos 13 anos, ela lutou para segurar um lápis.

"Há certos músculos que simplesmente não tenho mais", diz ela durante uma visita recente ao laboratório. Ela está sentada em uma mesa de conferência, onde uma dúzia de pesquisadores do grupo de Conklin se reuniram para conhecê-la, muitos deles pela primeira vez.

Os pesquisadores conhecem suas células intimamente, no entanto. Eles os isolaram de amostras de seu sangue e os alimentaram em placas de petri. Eles eliminaram essas células sanguíneas com um coquetel de genes que as transforma em células-tronco, células indiferenciadas que podem crescer indefinidamente. Usando outro coquetel genético, eles persuadiram as células-tronco a se tornarem células nervosas, como as que estão na raiz da doença de Van Riper. Eles examinaram essas células nervosas doentes através de microscópios, estudaram sua mutação problemática e enviaram sistemas CRISPR para tentar removê-las.

Durante todo o tempo, Conklin e sua equipe sonharam com um dia em que um médico poderia injetar moléculas CRISPR diretamente na espinha de Van Riper para curar as células nervosas de lá; um dia em que o sucesso desta cirurgia piloto levará a mais operações CRISPR para mais doenças; um dia em que pacientes que uma vez não tiveram esperança virão a São Francisco de todo o mundo para procurar esses tratamentos.

Bruce Conklin, MD, está explorando como a tecnologia CRISPR poderia tratar doenças genéticas. (Crédito da foto: Steve Babuljak)

Agora os pesquisadores querem saber tudo sobre esse adolescente de cabelos escuros que usa jeans skinny pretos, tênis Converse e um anel labial; que tem dificuldade em usar as mãos e às vezes tropeça nos pés, mas se senta com uma postura requintada; que fala de maneira eloquente e vulnerável sobre a doença que uma vez a fez questionar quem ela é e inspirou-a a se tornar uma escritora e pioneira em medicina.

"Como se sente ao fazer parte deste projeto?", Pergunta alguém.

"É bom perceber que as pessoas estão procurando uma solução para pessoas como eu que não têm nenhuma solução", diz Van Riper. "Eu sinto que você realmente se importa." Ela sorri e acrescenta: "Eu gosto de nerds."

"Você se preocupa com os riscos?"

“Eu vivi o suficiente para ter uma experiência de vida com uma deficiência. Se algo der errado, não acho que seria tão assustador quanto algumas pessoas pensam. Não podemos saber até fazermos isso. Eu estou bem sendo essa pessoa fazendo isso.

"Você é realmente corajoso."

“Eu sei que não é uma correção certa. Secretamente, acho que vai funcionar.

O mesmo acontece com muitos dos pacientes voluntários de Conklin. Alguns, como Van Riper, têm CMT; outros têm mutações genéticas que causam a doença BEST, uma doença ocular que leva à cegueira.

A equipe de Conklin está começando com essas duas doenças raras por vários motivos. Primeiro, cada um deles surge de mutações bem conhecidas em um único gene, tornando as cirurgias CRISPR relativamente simples de projetar. Segundo, eles afetam os tecidos onde os sistemas CRISPR podem ser facilmente administrados e seus efeitos facilmente medidos. Terceiro – e talvez o mais importante – essas doenças são atualmente intratáveis; qualquer alívio de sua devastação vale, para a maioria dos pacientes, os riscos potenciais (que podem incluir, por exemplo, cortes em partes indesejadas do genoma).

"Quase universalmente, os primeiros alvos da cirurgia do genoma serão as doenças incuráveis, onde realmente não há outra opção", diz Conklin. "Se pudermos tratá-los, isso abrirá as portas para um novo tipo de medicamento".

Inesperado inesperado

É fácil ver, até mesmo para os pesquisadores envolvidos, como a promessa da cirurgia do genoma pode soar mágica. É claro que o processo não é mágico, mas uma operação molecular muito real, embora excepcional, que traça sua origem até uma fonte despretensiosa.

A partir da década de 1980, biólogos estudando bactérias e outros microorganismos notaram regiões estranhas do DNA em seus genomas. Surpreendentemente, as regiões continham segmentos que eram palíndromos – eles lêem o mesmo para trás – e repetidos em intervalos regulares, como livros em que cada parágrafo começa com a palavra “RACECAR”. Essas esquisitices deram aos segmentos sua boca cheia de nome: agrupou repetições palindrômicas curtas inter espaçadas, logo encurtadas para CRISPRs.

Eventualmente, os pesquisadores determinaram que os CRISPRs armazenam pedaços de DNA roubados de vírus invasores, como quadros em torno de fotos de criminosos. Toda a região do DNA serve como uma espécie de força de defesa microbiana: os genes perto do código CRISPR para moléculas defensoras, chamadas de proteínas associadas a CRISPR (Cas), que executam vírus cortando seu DNA; as imagens virais, copiadas em moléculas de RNA que se prendem às proteínas Cas, servem como guias dos defensores.

A doença genética de sítio único pode agora ter cura graças à cirurgia do genoma.

Por décadas, a pesquisa CRISPR permaneceu um nicho relativamente obscuro da biologia. Então, em 2012, uma equipe liderada por Doudna e Emmanuelle Charpentier, PhD da UC Berkeley, então da Universidade Umeå da Suécia e agora diretora do Instituto Max Planck de Biologia Infecciosa em Berlim, publicou um trabalho que lançou a CRISPR para a fama científica.

O artigo descreveu como uma determinada proteína Cas, a Cas9, poderia ser direcionada para cortar não apenas os vírus invasores de bactérias, mas também qualquer parte do DNA, simplesmente mudando o guia de RNA do Cas9. Essa capacidade – de criar um editor de DNA específico ao fornecer uma molécula de RNA específica – foi revolucionária. O RNA, afinal, é fácil de fazer no laboratório. Os cientistas poderiam, portanto, construir uma infinidade de novas ferramentas baseadas no Cas9 em uma fração do tempo e por uma fração do custo das tecnologias anteriores. [Veja “ Edição do Genoma Antes de CRISPR: Uma Breve História .”]

Esta descoberta provocou um frenesi CRISPR. Em todo o mundo, os laboratórios rapidamente adotaram o chamado sistema CRISPR-Cas9, usando-o para recortar e unir genes em bactérias, fungos, plantas, animais e, é claro, células humanas. "Foi impressionante a rapidez com que se espalhou", lembra Doudna. Logo, os pesquisadores estavam reformulando Cas9 para criar ferramentas CRISPR com habilidades mais diversas, expandindo assim o bisturi de Cas9 em uma variedade de instrumentos cirúrgicos.

Em 2013, por exemplo, Doudna se juntou a vários pesquisadores da UCSF – incluindo Stanley Qi, PhD (agora em Stanford); Luke Gilbert, PhD (o professor de Goldberg-Benioff); Jonathan Weissman, PhD; e Wendell Lim, PhD – para mostrar que uma versão mutada do Cas9, chamada Cas9 “morta”, ou dCas9, poderia se ligar a um alvo de DNA, mas não cortá-lo. Esse insight provou ser incrivelmente proveitoso: ao fundir várias outras moléculas no dCas9, a equipe poderia usar os sistemas resultantes para discar ou reduzir a expressão gênica sem alterar o DNA subjacente. "Agora nós tivemos uma mudança de volume", diz Weissman, professor de farmacologia celular e molecular e co-diretor do IGI.

Outros laboratórios logo encontraram mais complementos: tags moleculares para rastrear o comportamento dos genes; revisores moleculares para editar bases simples; escudos moleculares para impedir cortes desonestos; interruptores moleculares para permitir o controle remoto. "Foi incrível", diz Weissman. "Em apenas seis anos, fizemos tudo o que queríamos e muito mais."

O desafio agora para os cirurgiões do genoma é descobrir quais combinações de sistemas CRISPR, em que ordem e sob quais condições, tratarão um paciente em particular com uma doença em particular com segurança e eficácia.

Na fronteira médica

De volta ao laboratório de Marson, Roth misturou os ingredientes para seu sistema CRISPR “mágico” em um frasco e os deixou sob calor para permitir a montagem. Agora, usando uma pipeta semelhante a uma seringa, ele suga as moléculas de CRISPR e as divide, esguichando por minúsculo esguicho, entre os poços de uma placa em forma de favo de mel. Lá, ele testará o sistema em células T humanas – um tipo de célula imunológica – para ver como funciona bem seu procedimento cirúrgico.

“Em um ambiente clínico, isso seria feito por um robô”, diz ele, como se já estivesse prevendo um dia em que toda essa consertar – e tediosa pipetagem – não apenas satisfaz as curiosidades científicas, mas também salva vidas.

“A cirurgia de genoma não é apenas sobre o reparo do DNA. Também queremos colocar novas seqüências em células que transmitam novas funções terapêuticas. ”- Theo Roth

Em seguida, ele adiciona aos poços outro ingrediente: genes. Esses genes específicos codificam uma proteína chamada receptor sintético de células T, ou TCR. Empoleirados na superfície das células T como guardas de fronteira, os receptores detectam partículas tóxicas ou patógenos que entram no corpo, instigando assim um ataque imunológico. Um TCR sintético é um receptor feito em laboratório projetado especificamente para reconhecer células cancerígenas – neste caso, algumas formas de melanoma. Se tudo correr como Roth espera, o sistema CRISPR combinará os genes do TCR no DNA das células T precisamente onde ele quiser, transformando as células em agentes que matam o câncer. (Em 2017, a Food and Drug Administration dos EUA aprovou duas terapias de células T de gerações mais antigas que usam tecnologias não CRISPR, uma para leucemia linfoblástica aguda e outra para linfomas avançados.)

Theo Roth, um estudante de MD / PhD, está desenvolvendo cirurgias baseadas em CRISPR destinadas a reprogramar as próprias células imunológicas dos pacientes para tratar o câncer e o HIV. (Crédito da foto: Elena Zhukova)

"A cirurgia do genoma não é apenas sobre a reparação do DNA", diz Roth, agora pipetagem das células T humanas nos poços de teste para se misturar com as moléculas CRISPR e os genes TCR. "Nós também queremos colocar novas seqüências em células que transmitem novas funções terapêuticas."

Finalmente, ele desliza toda a placa do poço – com sua horda de moradores – para uma engenhoca do tamanho de uma caixa de pão: um eletroporador. Clique, clique, clique em vai o eletroporador, entregando uma série de choques elétricos suaves. Os choques tornam as membranas semelhantes a sacos de células T permeáveis, deixando as moléculas CRISPR e os genes TCR passarem. Quando finalmente o eletroporador ejeta as células, Roth as coloca em uma incubadora para aquecer.

Alguns dias depois, após o sistema CRISPR ter tido tempo de realizar seus truques, ele analisará os dados. Ele irá determinar, para sua satisfação, que eles são "um pouco como esperávamos". Então ele vai começar a preparar a próxima corrida experimental – uma das centenas que ele fez no ano passado e continuará a fazer nos próximos meses – a esperança de tornar o procedimento um pouco mais fácil, um pouco mais seguro, um pouco mais eficaz.

Como a maioria dos pioneiros da cirurgia genômica, ele está cautelosamente otimista de que seus esforços compensarão. A rápida ascensão da tecnologia CRISPR, seguida pelo progresso terapêutico precoce, deu aos cientistas e médicos a mesma razão para terem esperança – de se sentirem encorajados, como diz Doudna, de que isso é algo que nos próximos anos estará cada vez mais disponível. pacientes."

Ao mesmo tempo, muitas questões importantes permanecem: Como os médicos fornecerão os sistemas CRISPR a tecidos de difícil acesso, como o coração? Como eles vão tratar doenças com muitas mutações genéticas subjacentes e interagentes? Como eles educarão os pacientes sobre os riscos e benefícios? Quais são exatamente os riscos e benefícios? Quais são as doses adequadas? Como essas cirurgias serão reguladas? Quem os executará? Quem vai pagar por eles? Quem terá acesso a eles?

“Ainda há muito trabalho a ser feito”, diz Roth, falando em campo e também em si mesmo. Ele e seus colegas são como engenheiros da Apollo – aprimorando mais um sensor, executando mais uma simulação – antes de lançar um voo espacial, com astronautas a bordo, no desconhecido estrelado.

Mesmo antes do lançamento, as terapias CRISPR já são uma peça de resistência – um testemunho de até onde a ciência nos levou e onde ela ainda pode levar.